Neuritin C56S突變對(duì)Neuritin蛋白結(jié)構(gòu)、活性和熱穩(wěn)定性的影響

打開(kāi)文本圖片集

摘要： 目的 蛋白質(zhì)分子內(nèi)半胱氨酸殘基形成的二硫鍵是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)非常重要的穩(wěn)定力。本研究通過(guò)突變Neuritin蛋白活性片段的C56S，觀察56位點(diǎn)的半胱氨酸對(duì)Neuritin蛋白的結(jié)構(gòu)形式、活性及熱穩(wěn)定性的影響。方法 通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果和來(lái)自生物信息學(xué)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，明確了突變位點(diǎn)；利用重疊延伸PCR技術(shù)，構(gòu)建了插入正確的pPIC9K-Neuritin C56S突變體穿梭質(zhì)粒；電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115后，經(jīng)G418抗藥性篩選、基因型鑒定和高表達(dá)篩選，成功獲得了突變體酵母重組子，并最終得到了表達(dá)量最高的菌株；利用我們已建立的純化工藝，對(duì)Neuritin C56S突變體蛋白進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE還原電泳考馬斯亮藍(lán)染色鑒定、Western blot免疫原性鑒定；隨后利用SDS-PAGE非還原電泳考馬斯亮藍(lán)染色完成存在形式的鑒定；利用本課題組前期按照藥典建立的重組Neuritin蛋白生物學(xué)活性檢定方法，通過(guò)觀察海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞存活情況，檢測(cè)Neuritin C56S突變體蛋白的活性；并完成了在37℃下，不同時(shí)間點(diǎn)Neuritin C56S突變體純化蛋白降解情況的檢測(cè)分析。（剩余16447字）