坦布蘇病毒RNA復(fù)制子系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用

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摘要：黃病毒RNA復(fù)制子在病毒致病機制、新型疫苗和藥物研發(fā)上應(yīng)用廣泛，而坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）是我國新發(fā)現(xiàn)的以引起水禽產(chǎn)蛋量下降為主要特征的黃病毒屬成員。為構(gòu)建TMUV RNA復(fù)制子，本研究以TMUV JXSP株感染性克隆為基礎(chǔ)，利用Overlap PCR分別對病毒基因組進行CPrME、CPrM、PrME和PrM等4種方式結(jié)構(gòu)蛋白基因的缺失，并在缺失部位插入綠色熒光蛋白報告基因，報告基因下游連接口蹄疫病毒2A蛋白基因序列，獲得的基因組全長PCR融合產(chǎn)物純化后，體外轉(zhuǎn)錄成mRNA，并轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，采用熒光顯微鏡觀察不同時間點綠色熒光蛋白的表達；利用構(gòu)建的TMUV RNA復(fù)制子，將綠色熒光蛋白基因替換為H9亞型禽流感病毒HA基因，mRNA轉(zhuǎn)染細胞72 h后Western blotting檢測蛋白表達。（剩余7566字）