利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備BLG基因敲除牛乳腺上皮細胞系

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摘 要： 旨在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建BLG基因敲除牛乳腺上皮細胞系（bovine mammary epithelial cells， bMECs），同時檢測BLG基因敲除后對細胞的影響。本研究利用體外切割試驗篩選獲得靶向牛的BLG基因的第一外顯子序列的3條sgRNA，與CRISPR/Cas9表達載體電轉(zhuǎn)染入 bMECs，利用濃度為1.8 μg·mL-1嘌呤霉素和6 μg·mL-1稻瘟菌素雙藥篩和PCR分析鑒定獲得BLG基因編輯的單克隆細胞株；利用Western blot（WB）驗證細胞BLG表達；繪制生長曲線和CCK-8試驗檢測BLG基因敲除對bMECs細胞增殖的影響；同時根據(jù)sgRNA序列，對基因組上潛在脫靶位點進行PCR測序分析。（剩余18781字）