基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建PAX3-FOXO1融合基因敲除腺泡狀橫紋肌肉瘤細(xì)胞模型

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摘要：目的 使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定敲除PAX3-FOXO1融合基因的人腺泡狀橫紋肌肉瘤（ARMS）細(xì)胞系（RH30），并驗(yàn)證PAX3-FOXO1功能。方法 運(yùn)用在線網(wǎng)站針對(duì)PAX3、FOXO1設(shè)計(jì)sgRNA，選擇切割效率最高的一組構(gòu)建LV-PAX3-sgRNA、LV-FOXO1-sgRNA及LV-Cas9慢病毒載體；LV-Cas9病毒感染RH30細(xì)胞，潮霉素篩選后，通過RT-PCR及qRT-PCR檢測(cè)RH30-Cas9細(xì)胞中Cas9基因表達(dá)；LV-PAX3-sgRNA及LV-FOXO1-sgRNA慢病毒載體分別感染RH30-Cas9細(xì)胞，流式分選篩選熒光陽性細(xì)胞；Sanger測(cè)序、PCR等分別驗(yàn)證RH30-PAX3-KO細(xì)胞及RH30-FOXO1-KO細(xì)胞中PAX3-FOXO1表達(dá)；EDU、TUNEL、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲除RH30-PAX3-KO細(xì)胞及RH30-FOXO1-KO細(xì)胞功能改變。（剩余16806字）